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從測定波長來考慮,該如何選擇合適的酶標(biāo)儀

更新時間:2022-07-20      點擊次數(shù):2937
一般酶標(biāo)儀的測定波長在400~750nm或800nm之間,可以滿足ELISA的顯色測定。ELISA試劑盒所使用的標(biāo)記用酶均為辣根過氧化物酶(HRP),底物通常為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD),其在過氧化氫溶液的存在下,經(jīng)HRP作用,分別氧化為2,2,—二氨基偶氮苯(DAB)和聯(lián)苯醌。當(dāng)pH值為5.0左右時,DAB在450nm波長處有最大吸收,當(dāng)pH值降為L0時,最大吸收波長移至492nm,同時摩爾消光系數(shù)變大,顯色加深,因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長450nm處有最大消光系數(shù),如果HRP量少,H:O:和TMB過量時,則形成藍(lán)色的陽離子根。降低pH,即可使藍(lán)色的陽離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌,使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min。因此,450nm和492 nm兩個波長是目前ELISA測定常用的。各種酶標(biāo)儀都配有放置濾光片的可自動轉(zhuǎn)換的部件,可以同時安裝6~8片濾光片,所配備的濾光片均應(yīng)包括上述兩個波長,有的酶標(biāo)儀以490nm濾光片替代492nm濾光片,影響不大。
除了這兩個基本濾光片外,考慮到雙波長比色的需要,還應(yīng)有620nm或630nm或650nm和405nm波長的濾光片,其他濾光片可根據(jù)自己的需要選擇。有時,有的實驗室希望用酶標(biāo)儀作微量生化測定,故酶標(biāo)儀生產(chǎn)廠家對其生產(chǎn)的酶標(biāo)儀擴(kuò)展了紫外檢測功能,此時需要一個340nm波長濾光片。此時,酶標(biāo)儀的測定波長范圍就成為340—750nm或800nm。
酶標(biāo)儀有單波長和雙波長檢測功能。有時使用者不知在什么情況下使用單或雙波長檢測。所謂的“單波長”就是使用一種對顯色具最大吸收的波長即450nm或492nm進(jìn)行比色測定;而“雙波長”則除了用對顯色具最大吸收的波長即450nm或492nm進(jìn)行比色測定外,同時用對特異顯色不敏感的波長如630nm進(jìn)行測定,酶標(biāo)儀最后打印出來的吸光度則為二者之差。630nm波長下得到的吸光度是非特異的,來自于板孔上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此,在ELISA比色測定中,最好使用雙波長,且不必設(shè)空白孔。
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